普洱学院，云南普洱665000
摘要:棒叶落地生根植株干旱20 d与70 d，并对干旱70 d的植株进行复水处理，测定叶片中抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）与脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的活性，以及抗坏血酸（AsA）与谷胱甘肽（GSH）含量的变化。结果表明，随着干旱进行，APX与DHAR活性均显著增加，GR活性先增加后降低；AsA、脱氢抗坏血酸（DHA）含量与AsA/DHA比值均显著增加，GSH含量增加但不显著，氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量显著增加，GSH/GSSG比值增加但不显著。复水后叶片中APX、DHAR活性显著低于干旱70 d时，GR活性高于干旱70 d时；AsA、DHA含量与AsA/DHA比值显著低于干旱70 d时，GSH、GSSG含量与GSH/GSSG比值低于干旱70 d时，但差异不显著。可见，在棒叶落地生根遭遇干旱时，AsA-GSH循环系统清除活性氧的能力提高。
关键词:棒叶落地生根；干旱；抗坏血酸；谷胱甘肽
Responses of Ascorbic Acid－Glutathione Cycle inKalanchoe tubiflora(Harv.) Raym.-Hamet Leaves to Drought and Rewatering
SU Zhi-Long, CUI Xian-Liang, LI Sun-Yang, LI Dong, LUO Yin-Ling*
Puer University, Yunnan Puer 665000
Abstract:The plants ofKalanchoe tubiflorawere treated by drought for 20 or 70 d and some of them were rewatered after 70 d drought. After treatment the activities of ascorbic acid peroxidase (APX), glutathione reductase (GR) and dehydroascorbate reductase (DHAR) and the contents of ascorbic acid (AsA) and glutathione (GSH) in leaves were determined. The results indicated that the activities of APX and DHAR increased with the
资助 云南省教育厅科学研究基金项目 (2010Y216).
progress of drought, and GR activities increased first and then decreased. AsA and dehydroascorbic acid (DHA) content and AsA/DHA ration increased significantly with drought. Meanwhile GSH content, oxidized glutathione (GSSG) content, and GSH/GSSG ration increased but the increases were not significant. After rewatering, activities of APX and GR decreased significantly compared with that in plants suffered drought for 70 d and GR activity increased. AsA and DHA content and AsA/DHA ration decreased significantly compared with that in 70 d –drought plants; the decease of GSH, GSSG content and GSH/GSSG ration also found but the difference was not significant. Therefore, the ability that scavenged ROS by AsA-GSH cycle inK. tubiflorawas improved after they suffered drought stress.
Key words:Kalanchoe tubiflora; drought; ascorbic acid; glutathione
根据CO2固定与卡尔文循环发生的差异，植物可以分为C3植物、C4植物与景天酸代谢（crassulacean acid metabolism，CAM）植物。CAM植物的CO2固定发生在夜里，因为它的气孔晚上打开、白天关闭；而它的卡尔文循环发生在白天[1]。CAM植物的这种代谢途径是对生境的一种适应。因为CAM植物起源于热带，且分布在干旱环境中，因此发展出一套生存策略，使CO2的固定与卡尔文循环在时间上分开，从而避免水分过快的流失。此外，CAM植物多为肉质植物，具有庞大的贮水组织，使植物保持较高的含水量。
CAM植物的这种代谢方式与结构特点，使它具有极强的耐旱性，能够在干旱条件下生存与繁殖。但是气孔开放时间的限制与叶片肉质的特点使CO2的吸收与扩散都受到限制，从而导致光合作用的碳同化（暗反应）减弱，而光反应在白天一直进行，能量不断被吸收，水的光解产生的氧气易导致更多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累[2]。ROS能引起生物大分子如核酸、蛋白质与脂类的氧化伤害，ROS的有效清除对保护植物免受干旱导致的氧化胁迫非常重要。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是活性氧清除系统中的第一道防线，可以把超氧阴离子转变成H2O2，而H2O2可以被过氧化氢酶（catalase，CAT）水解生成水。此外，抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）－谷胱甘肽（glutathione，GSH）循环可以有效的清除H2O2，减少氧化伤害。但在CAM植物中，植物遭遇干旱胁迫时AsA－GSH循环的反应研究很少。
棒叶落地生根是CAM植物[3]，与其他CAM植物一样具有很强的抗旱能力，俗称“打不死”。罗银玲等[4]发现棒叶落地生根在遭遇干旱胁迫时，渗透调节物质脯氨酸与可溶性糖积累显著增强，ROS积累增多，SOD活性增加，复水后各项参数均恢复到干旱前水平。而AsA－GSH循环在干旱与复水时是如何响应的尚不清楚，为此我们研究了AsA－GSH循环中三种抗氧化酶（AsA过氧化物酶，APX；脱氢抗坏血酸还原酶，DHAR；谷胱甘肽还原酶，GR）的活性以及AsA、GSH含量随干旱与复水的变化，以期揭示AsA－GSH循环在棒叶落地生根干旱胁迫时的作用。
材料与方法
1 植物材料
植物材料棒叶落地生根[Kalanchoe tubiflora(Harv.) Raym.-Hamet]的处理方式同罗银玲等[4]的方法。小苗采自普洱学院居民楼楼顶（北纬22°46’46’’，东经100°59’41’’），撒在盛满土的黑色的营养袋内（直径为20cm），于2011年8月—2012年1月在普洱学院生命科学系的温室内种植。当植株长至约15cm高时，开始进行干旱处理，处理方式为停止浇水，对照每2～3天浇水一次（not drought，ND）。干旱共有两个梯度，一是干旱20 d（D20），一是干旱70 d（D70）；并对干旱70 d的植株做复水处理（rewatering，RW），处理方式为在干旱70 d时对材料进行浇水，每隔2 d浇水一次，共浇3次，最后一次浇水后隔两天采样保存。
2 方法
2.1 APX、GR与DHAR活性测定
APX、GR与DHAR的提取与活性测定按照Jiang和Zhang[5]的方法进行。准确称取约0.7 g材料，加预冷的酶提取液5 mL，冰浴研磨成匀浆， 4 ℃、13, 000 g离心10 min。上清液用来测APX、GR与DHAR活性。APX反应液为磷酸缓冲液（pH 7. 0），含1 mmol·L-1AsA，4 mmol·L－1H2O2与0.1 mmol·L－1乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）。测定反应体系在290 nm处光吸收值的变化。GR反应体系为50 mmol·L－1磷酸缓冲液（pH 7. 8），含5 mmol·L－1MgCl2，1 mmol·L－1氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、1 mmol·L－1EDTA与2 mmol·L－1还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。测定反应体系在340 nm处光吸收值的变化。DHAR反应体系为50 mmol·L－1磷酸缓冲液（pH 7. 0），含0.4 mmol·L－1脱氢抗坏血酸（dehydroascorbic acid，DHA），3.5 mmol·L－1GSH与1 mmol·L－1EDTA。测定反应体系在265 nm处光吸收值的变化。
2.2 AsA、DHA与总抗坏血酸（total AsA，tAsA）含量测定
各类型抗坏血酸的测定参照Wang等[6]的方法进行。准确称取约0.4 g叶片，在4 mL预冷的6%（w/v）三氯乙酸溶液中研磨匀浆。匀浆液在10, 000 g，4 ℃离心15 min，上清液用来测定AsA含量。测定tAsA时,取0.5 mL 上清液，加入0.6 mL EDTA 的磷酸缓冲液(50 mmol·L－1，pH 7.4) 和0.2 mL 10 mmol·L－1的DTT。室温下放置50 min后，加入0.2 mL 0.5% N-乙基马来酰亚胺以消除多余的DTT；然后加入1 mL 10%三氯乙酸、0.8 mL 42%正磷酸溶液、0.8 mL 65 mmol·L－1双吡啶酒精（70%）溶液和0.4 mL 0.3% FeCl3溶液。混匀后42 ℃水浴60 min，测525 nm 处的吸光值。AsA的测定过程中以蒸馏水代替DTT 和N-乙基马来酰亚胺，其余操作步骤与总抗坏血酸相同。tAsA与AsA的差值即为DHA。标准曲线分别用AsA与DHA（0～5 mmol·L－1）进行测定。
2.3 GSH、GSSG与总谷胱甘肽（total glutathione，tGSH）含量测定
各类型谷胱甘肽的测定参照Griffith[7]的方法进行。准确称取约0.4 g植物材料，在4 mL预冷的7%（w/v）的5-磺基水杨酸中研磨匀浆，匀浆液在10, 000 g、4 ℃离心20 min，上清液用来测定谷胱甘肽含量。谷胱甘肽的反应液为50 mmol·L－1磷酸缓冲液，pH 7.4，含mmol·L－1EDTA、5 mmol·L－15,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)、5 mmol·L－1NADPH与1 U GR。总谷胱甘肽测定时，90 μL上清液、10μL蒸馏水与1.9 mL反应液混匀，27 ℃水浴30 min后，412 nm处比色。GSSG测定时90 μL上清液与10 μL 1 mmol·L－12-乙烯基吡啶在27 ℃水浴中1 h除去GSH；然后加入1.9 mL反应液，27 ℃水浴30 min后，412 nm处比色。tGSH与GSSG的差值即为GSH。标准曲线分别用GSH与GSSG（0～100 μmol·L－1）进行测定
3 统计分析
数据分析采用单因素方差分析，用R软件进行分析[8]。并用Tukey’s HSD检验进行了多重比较分析。
实验结果
棒叶落地生根植株干旱20 d与70 d后，土壤含水量与叶片的相对含水量都显著下降（罗银玲等, 已接受）。棒叶落地生根的对照叶片相对含水量为95.68%；在植株干旱20 d与70 d后，叶片的相对含水量分别下降到92.09%与86.19%；干旱70 d后复水，叶片的相对含水量升至93.51%。未进行干旱处理的对照，土壤的含水量为31.85%；干旱20 d与70 d后，土壤含水量下降到1.03%与0.42%。
1 APX、GR与DHAR活性
棒叶落地生根叶片中APX活性随干旱时间增加而显著升高（图1-A，P<0.001）。未干旱的对照叶片中，APX活性为2.94 μmol (AsA)·mg-1(蛋白)·min-1，干旱处理20 d后，升至5.78 μmol (AsA)·mg-1(蛋白)·min-1；干旱70 d后，升至12.16 μmol (AsA)·mg-1(蛋白)·min-1。复水后，APX活性比干旱处理时低，降至6.54 μmol (AsA)·mg-1(蛋白)·min-1。干旱与复水处理显著影响GR活性（图1-B，P<0.001）。未干旱的对照叶片中，GR活性为2.00 μmol (NADPH)·mg-1(蛋白)·min-1，干旱处理20 d后，升至2.45 μmol (NADPH)·mg-1(蛋白)·min-1；干旱70 d后，又下降到1.44 μmol (NADPH)·mg-1(蛋白)·min-1。而复水后，GR活性比干旱处理时高，增至2.87μmol (NADPH)·mg-1(蛋白)·min-1。干旱与复水处理也显著影响DHAR活性（图1-C，P<0.001）。未干旱的对照叶片中，DHAR活性为0.63 μmol (AsA)·mg-1(蛋白)·min-1。干旱20 d与干旱70 d 处理都使DHAR活性升高至0.93 μmol (AsA)·mg-1(蛋白)·min-1。复水后DHAR活性下降，降至0.06 μmol (AsA)·mg-1(蛋白)·min-1。
图1干旱与复水对棒叶落地生根叶片中APX、GR与DHAR活性的影响。A：APX活性；B：GR活性；C：DNAR活性。ND，未干旱；D20，干旱20 d；D70，干旱70 d；RW，复水。ANOVA检验差异显著性, 不同小写字母表示不同处理之间在0.001水平上存在显著差异，相同字母表示不存在显著差异。
Fig. 1 Effects of drought and rewatering on activities of APX, GR and DHAR inK. tubifloraleaves.
2 AsA、DHA与tAsA含量
棒叶落地生根叶片中AsA含量随干旱时间增加而显著增高（表1，P<0.001）。未干旱的对照叶片中，AsA含量为4.01 μmol·g-1(DW)，干旱处理20 d后，升至17.84 μmol·g-1(DW)；干旱70 d后，升至52.66 μmol·g-1(DW)。复水后为28.44 μmol·g-1(DW)，显著低于干旱70 d的植株（P<0.001），但显著高于对照与干旱20 d的（P<0.001）。干旱与复水处理显著提高DHA含量（表1，P<0.001）。未干旱的对照叶片中，DHA含量为2.81 μmol·g-1(DW)，干旱处理20 d与70 d后，分别升至9.16与20.65 μmol·g-1(DW)。复水后DHA的含量为19.78 μmol·g-1(DW)，略低于干旱70 d的叶片，但差别不显著（P>0.05）；显著高于对照与干旱20 d的植株。由于以上AsA与DHA的变化，叶片中tAsA含量随着干旱显著增高（表1，P<0.001）。复水后tAsA含量显著低于干旱70 d的（P<0.001）并显著高于对照与干旱20 d的（P<0.001）。AsA/DHA比值随干旱增高（表1，P<0.01），但干旱20 d增高的不显著（P>0.05），干旱70 d 显著增加（P<0.01）。
表1 干旱与复水对棒叶落地生根叶片中AsA、DHA和总抗坏血酸含量的影响
Table 1 Effects of drought and rewatering on contents of AsA, DHA and total AsA inK. tubifloraleaves.
| 处理 |
含量/nmol·g-1(DW) |
GSH/GSSH |
| GSH |
GSSG |
tGSH |
| ND |
4.01±0.25a |
2.81±0.34a |
6.82±0.28a |
1.45±0.25a |
| D20 |
17.84±0.89b |
9.16±1.38b |
27.00±2.11b |
1.97±0.25a |
| D70 |
52.66±0.53d |
20.65±2.73c |
73.31±2.53d |
2.58±0.34b |
| RW |
28.42±0.93c |
19.78±1.64c |
48.20±0.71c |
1.45±0.16a |
ND，未干旱；D20，干旱20 d；D70，干旱70 d；RW，复水。数据分析采用R软件的单因素方差分析，并用Tukey’s HSD检验进行多重比较。不同的小写字母表示在同一行内不同处理之间在0.001水平上存在显著差异，相同字母表示不存在显著差异。
3 GSH、GSSG与tGSH含量
表2 干旱与复水对棒叶落地生根叶片中GSH、GSSG和tGSH含量的影响
Table 2 Effects of drought and rewatering on contents of GSH, GSSG and tGSH inK. tubifloraleaves
| 处理 |
含量/nmol·g-1(DW) |
GSH/GSSH |
| GSH |
GSSG |
tGSH |
| ND |
12.97±4.32a |
36.03±2.50a |
49.00±2.50a |
0.37±0.14a |
| D20 |
39.98±8.88a |
53.31±4.44b |
93.29±11.75b |
0.75±0.15a |
| D70 |
42.80±9.22a |
67.88±6.76b |
110.68±8.85b |
0.64±0.16a |
| RW |
33.78±11.17a |
57.71±2.44b |
91.49±10.63b |
0.59±0.20a |
ND，未干旱；D20，干旱20 d；D70，干旱70 d；RW，复水。数据分析采用R软件的单因素方差分析，并用Tukey’s HSD检验进行多重比较。不同的小写字母表示在同一行内不同处理之间在0.001水平上存在显著差异，相同字母表示不存在显著差异。
棒叶落地生根叶片中GSH含量随干旱时间增加，但增加不显著（表2，P>0.05）。未干旱的对照叶片中，GSH含量为12.97 nmol·g-1(DW)，干旱处理20 d后，升至39.98 nmol·g-1(DW)；干旱70 d后，升至42.80 nmol·g-1(DW)。复水后为33.78 nmol·g-1(DW)。干旱与复水处理显著提高GSSG含量（表2，P<0.001）。未干旱的对照叶片中，GSSG含量为36.03 nmol·g-1(DW)，干旱处理20 d与70 d后，分别升至53.31与67.88 nmol·g-1(DW)。复水后GSSG的含量为57.71 nmol·g-1(DW)，与干旱处理的差别不显著（P>0.05）；但显著高于对照。由于以上GSH与GSSG的变化，叶片中tGSH含量随着干旱显著增高（表2，P<0.001）。复水后tGSH含量显著显著高于对照（P<0.001），但与干旱20 d与70 d的无显著差异（P>0.05）。GSH/GSSG比值随干旱增高，但各处理之间差异不显著（表2，P>0.05）。
讨论
AsA与GSH是AsA－GSH 循环体系中主要的抗氧化分子，不需酶催化可与单线态氧（1O2）、H2O2和羟自由基（·OH）等ROS反应，直接清除ROS[9]。此外，APX以AsA为电子供体催化细胞内H2O2转变成H2O，是植物组织细胞清除H2O2的主要抗氧化酶；GR是一种黄素蛋白氧化还原酶，利用NADPH将GSSG还原成为GSH，GR高活性使细胞中的谷胱甘肽库处于还原态，确保AsA还原再生有充足还原力，为DHAR提供充足GSH，将DHA还原为AsA。因而APX、GR与DHAR是AsA－GSH 循环的关键酶，并在植物抗氧化系统中发挥重要作用[10,11]。
AsA/DHA和GSH/GSSG比值是细胞氧化还原态的动态指标, 其比值升高表明细胞向还原态转移，此时具有较强的清除自由基的能力；而下降表明细胞向氧化状态转移[12]。在苹果叶片中，轻度与中度干旱均导致AsA、DHA、GSH、GSSG含量增高[13]。在棒叶生根干旱处理后，AsA/DHA比值显著增加，GSH/GSSG比值增加但不显著；这表明干旱导致叶片氧化还原态向还原状态转移。此外在干旱时叶片中tAsA与tGSH含量显著增加，说明在棒叶落地生根中AsA作为抗氧化分子清除自由基的能力增加的比例较大。除作为抗氧化分子直接清除自由基外，AsA与GSH可通过参与AsA－GSH循环清除H2O2。棒叶落地生根干旱处理后，叶片中的APX活性增强，结合AsA含量增高，说明APX清除H2O2的能力增强。干旱时GR活性先增加后降低，因为GR催化GSSG转化为GSH，所以GSH含量部分地受到GR活性的影响，在干旱20 d后升高，但在干旱70 d时并未降低，这说明叶片内GSH含量除了与氧化还原有关外，还与它的合成系统有关。DHAR在干旱时酶活性显著增强，因为它催化所需的底物DHA含量显著增加而GSH含量增加但不显著，因此由DHAR酶促反应产生的AsA的量在干旱时应该也增加，但是干旱70 d的叶片中AsA含量比对照增加的倍数（约13倍）比GSH增加的倍数（约4倍）大，而DHAR活性增加不到2倍，因此AsA含量的增高除与AsA－GSH系统有关外，也与它的合成系统有关。
复水后，AsA/DHA比值又降低至未干旱水平，GSH/GSSG比值也降低至接近未干旱水平，可见复水引起氧化还原态回到未干旱状态。AsA与GSH含量虽然仍高于对照，但比未复水的干旱70 d的植株低，说明此时叶片中AsA与GSH清除自由基的能力降低。复水后APX与DHAR活性降低，GR活性增高。罗银玲等[4]在同样进行干旱处理的棒叶落地生根叶片中检测到比对照较高的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧阴离子生成速率以及H2O2含量。因此我们认为棒叶落地生根在未进行干旱时，抗氧化系统的产生与清除是平衡的，随着干旱导致的ROS增加，诱导了抗氧化分子的合成与抗氧化酶的表达，但此时抗氧化系统仍然不能清除过量的ROS，因此导致了比对照更大的氧化伤害；复水后植物的代谢趋于正常，因此ROS产生降低，从而引起抗氧化分子含量降低与抗氧化酶活性降低。
参考文献
[1] 武维华. 植物生理学[M]. 第二版. 北京: 科学出版社, 2002: 162—164.
[2] Lüttge U. CO2-concentrating: consequences in crassulacean acid metabolism [J]. J Exp Bot, 2002, 53 (378): 2131—2142.
[3] Stidham MA, Moreland DE, Siedow JN. 13C Nuclear magnetic resonance studies of crassulacean acid metabolism in intact leaves ofKalanchoe tubiflora[J]. Plant Physiol, 1983, 73(2): 517—520.
[4] 罗银玲, 毕廷菊, 苏志龙, 崔现亮, 兰芹英. 棒叶落地生根对干旱与复水的生理响应[J]. 热带亚热带植物学报, 2014, 22 (4): 391—398.
[5] Jiang M, Zhang J. Effect of abscisic acid on active oxygen species, antioxidative defence System and oxidative damage in leaves of maize seedlings [J]. Plant Cell Physiol, 2001, 42(11): 1265—1273.
[6] Wang SY, Jiao HJ, Faust M. Changes in ascorbate, glutathione and related enzyme activities during thidiazuron-induced bud break of apple [J]. Physiol Plant, 1991, 82 (2): 231— 236
[7] Griffith OW. Determination of glutathione disulphide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine [J]. Anal Biochem, 1980, 106 (1): 207—212.
[8] R Development Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R foundation for statistical computing. Vienna, Austria, 2012: http://www.R-project.org
[9] Meyer AJ. The integration of glutathione homeostasis and redox signaling [J]. J Plant Physiol, 2008, 165 (13): 1390—1403.
[10] Buchanan BB, Balmer Y. Redox regulation：A broadening horizon [J]. Ann Rev Plant Physiol, 2005, 56 (1): 187—220.
[11] 高吉霞, 龚春梅, 刘西平. 水分胁迫对刺槐叶和根谷胱甘肽抗氧化系统的影响 [J]. 西北植物学报, 2010, 30( 7) : 1409—1414.
[12] Meng G, Yao JM, Wang L, Zhao LC. Variation in glutathione status associated with induction and initiation of diapause in eggs of the bivoltine strain of the silkwormBombyx mori[J]. Physiol Entomol, 2011, 36 (2): 173—179.
[13] 马玉华, 马锋旺, 马小卫, 李明军, 王永红, 韩明玉, 束怀瑞. 干旱胁迫对苹果叶片抗坏血酸含量及其代谢相关酶活性的影响 [J]. 西北农林科技大学学报 (自然科学版), 2008, 36 (3): 150—160.
发表于2014年第6期。
编辑：林永
